普通PCR与TDPCR在临床医学科研中应用价值的比较
来源： [ 08-09-05 09:14:00 ] 作者：王楠，王养民，张斌 编辑：【摘要】 目的 比较普通聚合酶链反应（PCR）与降落聚合酶链反应(Touchdown PCR，TDPCR)在临床医学科研中的价值。方法 以人类外周血基因组DNA为模板，设计VHL基因3个外显子的3对引物，根据普通PCR及TDPCR原理设计包括3个外显子片段在内的PCR程序，通过试验选择PCR最佳反应条件，在同一程序中分别对3个片段进行扩增，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，纯化后PCR产物测序分析两种试验方法的差别。结果 电泳检测及纯化后DNA产物测序分析均显示TDPCR扩增产物条带特异性、效率较普通PCR扩增产物高。结论 成功建立了TDPCR方法，TDPCR方法较普通PCR更为高效实用，为临床基因突变筛查研究提供了快速可靠的手段。
【关键词】 基因 聚合酶链反应 降落聚合酶链反应
Abstract： Objective To compare the ordinary polymerase chain reaction (PCR) and touchdown (TD)PCR in clinical medical research. Methods We used genomic DNA from human peripheral blood as templates and designed three pairs of primers of VHL gene three exons. On the basis of the principle of PCR and TDPCR, we designed the programs, including the three exons. We chose the better reaction conditions through the PCR tests. The same programs were carried out on three fragments. The PCR products were detected by gel agarose electrophoresis. We analyzed the difference between the two methods by sequencing purified PCR products. Results It was indicated that TDPCR was more specific and effective than ordinary PCR, according to electrophoresis detection and sequencing analysis. Conclusion TDPCR, which acts as a rapid and reliable method, is more efficient than ordinary PCR for clinical gene mutation screening.
Key words： gene; polymerase chain reaction; touchdown polymerase chain reaction
自从20世纪80年代中期以来，聚合酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR)作为一种体外扩增DNA的方法，在分子生物学、法医学及一些人类基因疾病诊断等方面起到越来越重要的作用。PCR所具有的3个突出的特点（即选择性，特异性和快速性），使得DNA的克隆和操作变得十分简单。目前在一些临床基因突变筛查研究中，PCR作为基本实验手段，得到了广泛的应用,尽管如此，许多PCR实验中不但经常出现假阳性，而且实验结果往往并不太令人满意，也会造成无PCR产物，或电泳中出现大量非特异性二聚体条带。降落聚合酶链反应(Touchdown PCR，TDPCR)，最初是用于克服PCR中的假引发，作为一种行之有效的DNA体外扩增方法，在许多普通PCR无产物的基因扩增，都采用TDPCR，因此我们在VHL基因突变筛查中使用了普通PCR和TDPCR两种方法，并同时使用了TaKaRa Taq Hs进行了实验，期望能够得到良好的实验结果及建立TDPCR方法。
1 材料与方法
1．1 PCR扩增引物及模板 引物设计参考文献［1］，由大连宝生物工程有限公司合成。两组实验均以1例健康人类外周血基因组DNA为模板，外周血DNA提取采用大连宝生物工程有限公司D9081血液基因组提取试剂盒,严格按照说明书提取基因组DNA。
1．2 PCR扩增条件 50 μl 反应体系中包括：大连宝生物工程有限公司DR028A PCR混合浓缩试剂（Premix Taq Hot Start Version）25 μl，100 μmol/L 上下游引物各0.2 μl，基因组DNA100～200 ng，灭菌超纯水20.6 μl。
1．3 PCR扩增试剂及仪器 本次实验中使用的DR028A PCR混合浓缩试剂中含有的TaKaRa Taq Hs是抗Taq抗体和TaKaRa Taq的混合物，高温变性前抗Taq抗体与Taq酶结合，抑制聚合酶活性，能在低温条件下抑制引物的非特异性退火及引物二聚体的非特异性扩增，抗Taq抗体在PCR反应最初的DNA变性步骤中变性，无需特殊失活处理，在常规PCR条件下即可使用，同时PCR扩增产物3’末端含有一个“A”碱基，可直接连接T载体克隆。PCR所用仪器为美国ABI公司GeneAmp PCR System 9700型。
1．4 设计降落PCR程序 参考文献［2］所建议的TDPCR引物设计原则[从高于融解温度(Tm)值10 ℃，每次降低1 ℃(最终降至Tm值)]并做适当修改，对3对引物的Tm值进行预测，并根据全部退火温度值设定PCR循环程序中的温度变化范围，为照顾到3个片段，退火温度在最高65 ℃ 最低55 ℃ 的范围内，比较温度梯度以每降低1 ℃ 循环2次、最后在60～72 ℃ 再循环15次等一系列程序的扩增效果。
1．5 PCR 程序
1．5．1 普通PCR程序 循环参数为95 ℃ 预变性5 min，95 ℃ 变性45 s，第1、2和第3外显子的退火温度分别为63 ℃、59 ℃、57 ℃，退火45 s，72 ℃ 延伸45 s，30个循环后，72 ℃ 延伸10 min。
1．5．2 TDPCR程序 94 ℃ 预变性3 min；94 ℃ 46 s；65 ℃ 30 s，每次下降1 ℃ 直到55 ℃，每个温度上进行2轮循环反应；60 ℃45 s，72 ℃ 45 s，再循环15次；72 ℃ 延伸10 min；PCR产物在4 ℃ 下保存。
1．6 电泳 所有PCR产物均在2.0%(质量分数)琼脂糖凝胶中电泳，固定电压100 V。
1．7 纯化及测序 使用上海生工技术有限公司DNA胶回收试剂盒SK1132纯化PCR产物后，送该公司测序，所用测序仪器为ABI PRISM 3730，测序试剂为BigDye terminator v3.1。
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