川芎嗪对大鼠肾脏缺血/再灌注损伤保护作用及抗细胞凋亡作用

　　　川芎嗪对大鼠肾脏缺血/再灌注损伤保护作用及抗细胞凋亡作用

　　来源： [ 08-10-13 09:50:00 ] 编辑：作者：王汉民，谭华，赵洪雯，张鹏，黄朝晖，何丽洁，陈光磊，吴雄飞

　　【摘要】目的: 探讨川芎嗪对缺血/再灌注（I/R）损伤大鼠肾功能、肾脏组织形态学、细胞凋亡及相关基因表达的影响. 方法: 将大鼠随机分为假手术（S）组、I/R组、再灌注后给予川芎嗪（TMPpost）组、再灌注前给予川芎嗪（TMPpre）组，各组分别采用化学法测定血尿素氮和肌酐，光镜和电镜观察肾组织形态学变化，原位末端标记法检测肾脏细胞凋亡指数，免疫组化和免疫印迹法检测肾脏Bcl2和Bax蛋白的表达. 结果: TMPpre组较I/R组血尿素氮和肌肝显著降低，肾小管损伤评分减轻，分别为［（21.8±5.2）vs (31.1±4.4) mmol/L，P＜0.01) ］，［（196±55）vs （295±64）μmol/L，P＜0.01）］，［(372±46) vs （563±62），P＜0.01) ］；肾小管上皮细胞损伤及超微结构改变明显减轻，肾组织凋亡细胞数明显减少［（13.6±2.9） vs （28.8±4.6），P<0.01）］；Bcl2蛋白表达明显增强［（1.15±0.12） vs （0.88±0.12），P<0.05）］，Bax表达明显减弱［（0.87±0.11） vs （1.15±0.09），P<0.05）］. 结论: 川芎嗪可明显减轻I/R肾损伤，其保护作用机制与Bcl2蛋白表达增强和Bax蛋白表达减弱介导的肾脏细胞凋亡有关.

　　【关键词】川芎嗪；肾脏；再灌注损伤；细胞凋亡；保护

　　【Abstract】AIM: To explore Ligustrazine (Tetramethylpyrazine, TMP) on the effect of in rats wit rat renal functions, renal tissue morphology, cell apoptosis and expressions of related genes in rats with. METHODS: Forty Wistar rats of either sex were randomly divided into 4 groups, which were sham operation(n=10), I/R model(n=10), TMPpost (n=10, intraperitoneal TMP 32 mg/kg per 6 h after reperfusion for 30 min) and TMPpre (n=10, intraperitoneal TMP 32 mg/kg at 45 min, 8, 16, 24 h before ischemia) groups. Blood urea nitrogen and creatinine were detected by chemical method. Renal cell apoptotic index was examined by means of terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP nick end labeling(TUNEL). The expressions of Bcl2 and Bax in kidney was immunohistochemically evaluated and quantified by Western Blot analysis. The kidney histology were observed by light and electron microscope. RESULTS: Compared with those in the TMPpre group, the blood urea nitrogen［（21.8±5.2）vs (31.1±4.4) mmol/L，P＜0.01］, the creatinine ［（196±55） vs （295±64）μmol/L，P＜0.01）］ and the score of injury in renal tubules ［(372±46) vs （563±62），P＜0.01) ］ were decreased significantly in I/R group. The changes of injury and ultrastructure in tubular epithelial cells were significantly attenuated in TMPpre group. By Tetramethylpyrazine pretreatment, the apoptotic index (13.6±2.9 vs 28.8±4.6, P<0.01) and the expression of Bax (0.87±0.11 vs 1.14±0.09, P<0.05) were decreased significantly, and the expression of Bcl2(1.15±0.12 vs 0.88±0.12, P<0.05) was increased significantly as compared with that in I/R group. CONCLUSION: Tetramethylpyrazine can attenuate kidney I/R injury, and protective mechanism may be partly through inhibition of cell apoptosis by regulating the expressions of apoptosisrelated genes Bcl2 and Bax.

　　【Keywords】 tetramethylpyrazine; kidney; reperfusion injury; apoptosis; protection

　　0 引言

　　

　　川芎嗪是从伞形科植物川芎根茎中分离提纯的一种生物碱单体，其基本化学结构为四甲基吡嗪，具有扩张血管、改善微循环等作用，临床上广泛用于心脑血管疾病的治疗，并取得较好疗效. 川芎嗪对肾脏缺血/再灌注（I/R）损伤的保护作用已被大量研究证实［1-2］，但这种保护作用的机制尚不完全清楚，我们通过观察川芎嗪对I/R损伤大鼠肾功能、肾组织形态学、细胞凋亡及Bcl2和Bax蛋白表达的影响，进一步探讨川芎嗪对肾I/R损伤的保护作用机制.

　　1 材料和方法

　　1.1 材料健康成年Wistar大鼠40只，雌雄不拘，体质量200～240 g（第四军医大学实验动物中心），动物许可证号SCXK（军2002005），标准饲料，自由进食水，普通光照. 兔抗大鼠Bcl2和Bax mAb、兔抗βactin（Santa Cruz公司）；免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒（武汉博士德生物工程公司）；原位细胞凋亡(TUNEL)试剂盒（美国Roche公司）；细胞裂解液（美国BDBiosciences公司）；BCA试剂盒（美国Pierce公司）；SDS聚丙烯酰胺凝胶（美国Invitrogen公司）；硝酸纤维素膜（美国Life Science公司）；血尿素氮（BUN）、血肌酐（Cr）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；川芎嗪注射液（无锡第七制药厂，批号02081911）. JEM100SX型透射电镜（日本JEOL公司），凝胶图像分析系统（美国Kodak公司）等.

　　1.2 方法

　　1.2.1 分组及动物模型制备将40只大鼠随机分为4组，每组10只. S组：假手术对照组；I/R组：缺血再灌注模型组；TMPpost组：在I/R模型的基础上，再灌注30 min后腹腔注射川芎嗪，32 mg/kg，每6 h 1次，共4次；TMPpre组：在制备I/R模型前24，16，8 h，45 min腹腔注射川芎嗪, 32 mg/kg，I/R造模后不再注射川芎嗪. I/R模型制作参照Basile等方法进行［3］，用30 g/L戊巴比妥钠30～50 mg/kg腹腔注射麻醉，经腹正中切口暴露双侧肾脏，游离肾蒂，用无损伤动脉夹同时钳夹双侧肾动脉，阻断45 min后松开动脉夹. 假手术组仅游离双侧肾脏，暴露60 min后再关闭腹腔切口. 24 h后再用戊巴比妥钠麻醉大鼠，采血并摘取左肾，血标本以4000 r/min 离心10 min，分离血清，置-20℃保存用于测定BUN和Cr. 取部分肾组织分别用40 g/L甲醛和30 mL/L戊二醛固定以制备石蜡切片和电镜切片，另取部分肾组织迅速置入液氮中，然后于-80℃冰箱保存，用于提取蛋白.

　　1.2.2 肾功能测定测定血BUN采用二乙酰一肟显色法，测定血Cr采用碱性苦味酸比色法，应用721分光光度计测定.

　　1.2.3 肾组织学观察石蜡切片行HE和PAS染色，光镜下观察肾组织形态学改变，参照Paller等方法进行评分［4］，每只大鼠肾组织随机选择10个视野（×200），每个视野下随机选择10处肾小管，共按100个肾小管计分，分数越高表示肾小管损伤程度越严重. 电镜切片行醋酸铀和枸橼酸铅染色，在透射电镜下观察肾组织的超微结构变化.

　　1.2.4 肾组织细胞凋亡检测采用TUNEL检测细胞凋亡指数，参照TUNEL试剂盒说明书进行，显色采用DAB试剂盒进行. 光镜观察凋亡细胞，胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞. 于阳性表达分布区域、光镜200倍下随机选择5个无重叠视野，计数阳性细胞，以凋亡阳性细胞数占总细胞数的百分比作为细胞凋亡指数（AI）.

　　1.2.5 肾组织Bcl2，Bax免疫组化染色采用兔抗鼠Bcl2和Bax mAb，参照抗Bcl2和Bax试剂盒进行，显色采用DAB试剂盒进行. 光镜观察胞质中有棕色颗粒者为阳性细胞.

　　1.2.6 Western Blot检测肾组织Bcl2，Bax蛋白表达称取肾组织，按常规加入细胞裂解液，进行组织匀浆，取上清液用BCA试剂盒进行蛋白定量，经100℃ 10 min 变性后，用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离. 电泳后电转移至硝酸纤维素膜上，用丽春红染液染膜，脱脂奶粉于室温封闭，与Bcl2，Bax抗体37℃孵育4℃过夜. 摇洗并加入二抗室温孵育，再次洗涤，滴加显色液至硝酸纤维素膜上，X光胶片感光，用Kodak凝胶图像分析系统进行灰度扫描.

　　

　　统计学处理：计量资料用 x±s表示，多组样本均数之间比较采用单因素方差分析，各组间的两两比较采用多个均数间的多重比较（Dunnettt检验），应用SPSS13.0统计软件，P＜0.05为差异有统计学意义.

　　2 结果

　　2.1肾功能的变化各组血BUN和Cr变化见表1.

　　表1 各组血BUN和Cr、凋亡指数及肾小管损伤程度评分的比较（略）

　　aP＜0.05，bP＜0.01vs I/R组. S：对照组；I/R：缺血/再灌注组；TMPpost：I/R造模后给予川芎嗪；TMPpre：I/R造模前给予川芎嗪.

　　2.2 肾组织形态学改变各组肾小管损伤程度评分结果见表1. S组光镜观察肾组织无明显病变，电镜亦未见明显异常. I/R组光镜可见皮髓间有明显淤血带，肾小管上皮细胞刷状缘消失，出现空泡、滴状变性，严重者细胞脱落、坏死、基底膜裸露. TMPpost组光镜改变较I/R组有所减轻，而TMPpre组光镜改变较I/R组明显减轻，表现为部分肾小管上皮细胞刷状缘脱落、空泡及滴状变性少见、部分管腔扩张、可见少量管型. I/R组电镜可见部分肾小管上皮细胞核染色质致密，成团块状附在核膜上，出现染色质边集，上皮细胞空泡变性、刷状缘消失、线粒体减少或消失、内质网扩张. TMPpost组肾小管细胞超微结构损伤较I/R组有所减轻. TMPpre组肾小管上皮细胞超微结构损伤程度较I/R组明显减轻：表现为肾小管上皮细胞大部分结构相对完整，线粒体肿胀，少见空泡形成，核膜完整.

　　

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